薄层色谱法

概述薄层色谱法亦称薄层层析法。是将吸附剂或载体均匀地铺在玻璃板、塑料板或铝基片上形成一均匀薄层,待点样、展开后,与适宜的对照物按同法在同板上所得的色谱图对比,并可用薄层扫描仪进行扫描,用以进行药品的鉴别,杂质检查或含量测定的方法。按分离机制可分为吸附、分配、离子交换、凝胶过滤等法。适用于微量样品的分离鉴定,具有分离速度快,分离效率高的特点。薄层色谱法的定义薄层色谱法系将供试品溶液点样于薄层板上,经展开、检视后所得的色谱图,与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比,用于药品的鉴别或杂质检查的方法[1]。薄层色谱法的仪器与材料薄层板自制薄层板除另有规定外,玻璃板要求光滑、平整,洗净后不附水珠,晾干。...

概述

薄层色谱法亦称薄层层析法。是将吸附剂或载体均匀地铺在玻璃板、塑料板或铝基片上形成一均匀薄层,待点样、展开后,与适宜的对照物按同法在同板上所得的色谱图对比,并可用薄层扫描仪进行扫描,用以进行药品的鉴别,杂质检查或含量测定的方法。按分离机制可分为吸附、分配、离子交换、凝胶过滤等法。适用于微量样品的分离鉴定,具有分离速度快,分离效率高的特点。

薄层色谱法的定义

薄层色谱法系将供试品溶液点样于薄层板上,经展开、检视后所得的色谱图,与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比,用于药品的鉴别或杂质检查的方法[1]

薄层色谱法的仪器与材料

薄层板

自制薄层板除另有规定外,玻璃板要求光滑、平整,洗净后不附水珠,晾干。最常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶H和硅胶HF254,其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。其颗粒大小,一般要求粒径为5~40μm

薄层涂布,一般可分为无黏合剂和含黏合剂两种。前者系将固定相直接涂布于玻璃板上,后者系在固定相中加入一定量的黏合剂,一般常用10%~15%煅石膏(CaSO4·2H2O在140℃加热4小时),混匀后加水适量使用,或用羧甲基纤维素钠水溶液(0.2%~0.5%)适调成糊状,均匀涂布于玻璃板上。使用涂布器涂布应能使固定相在玻璃板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。

市售薄层板分普通薄层板和高效薄层板,如硅胶薄层板、硅胶GF254薄层板、聚酰胺薄膜和铝基片薄层板等。高效薄层板的粒径一般为5~7μm

点样器

常用具支架的微注射器或定毛细管,应能使点样位置正确、集中。

展开容器

应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸,并有严密的盖子,底部应平整光滑,或有双槽。

显色剂

见各品种项下的规定。可采用喷雾显色、浸渍显色或置适宜试剂的蒸气中熏蒸显色,用以检出斑点。

显色装置

喷雾显色要求用压缩气体使显色剂呈均匀

细雾状喷出;浸渍显色可用专用玻璃器皿或用适宜的玻璃缸代替;蒸气熏蒸显色可用双槽玻璃缸或适宜大小的干燥器代替。

检视装置

检视装置为装有可见光、短波紫外光(254nm)、长波紫外光(365nm)光源及相应滤片的暗箱,可附加摄像设备供拍摄色谱用,暗箱内光源应有足够的光照度

薄层色谱法的操作方法

薄层板制备

自制薄层板除另有规定外,将1份固定相和3份水在研钵中按同一方向研磨混合,去除表面的气泡后,倒入涂布器中,在玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布(厚度为0.2~0.3mm),取下涂好薄层的玻璃板,置水平台上于室温下晾干后,在110℃活化30分钟,即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查均匀度(可通过透射光和反射光检视)。

市售薄层板临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不需活化。铝基片薄层板可根据需要剪裁,但须注意剪裁后的薄层板底边的硅胶层不得有损。如在贮放期间被空气中杂质污染,使用前可用适宜的溶剂在展开容器中上行展开预洗,110℃活化后,置干燥器中备用。

点样

除另有规定外,用点样器点样于薄层板上,一般为圆点,点样基线距底边2.0cm,样点直径为2~4mm(高效薄层板为1~2mm),点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜,一般为1.0~2.0cm(高效薄层板可不小于5mm)。点样时必须注意勿损伤薄层板表面。

展开

展开缸如需预先用展开剂饱和,可在缸中加入足够量的展开剂,必要时在壁上贴两条与缸一样高、宽的滤纸条,一端浸入展开剂中,密封顶盖,使系统平衡或按各品种项下的规定操作。

将点好供试品的薄层板放入展开缸中,浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5~1.0cm(切勿将样点浸入展开剂中),密封顶盖,待展开至适宜的展距(如:20cm的薄层板,展距一般为10~15cm;10cm的高效薄层板,展距一般为5cm左右),取出薄层板,晾干,按各品种项下的规定检测

展开可以单向展开,即向一个方向进行;也可以进行双向展开,即先向一个方向展开,取出,待展开剂完全挥发后,将薄层板转动90°,再用原展开剂或另一种展开剂进行展开;亦可多次展开。

显色与检视

荧光薄层板可用荧光猝灭法;普通薄层板,有色物质可直接检视,无色物质可用物理或化学方法检视。物理方法是检出斑点的荧光颜色及强度;化学方法一般用化学试剂显色后,立即覆盖同样大小的玻璃板,检视。

系统适用性试验

按各品种项下要求对检测方法进行薄层色谱法系统适用性试验,使斑点的检测灵敏度、比移值(Rf)和分离效能符合规定。

检测灵敏度

系指杂质检查时,供试品溶液中被测物质能被检出的最低量。一般采用对照溶液稀释若干倍的溶液与供试品溶液和对照溶液在规定的色谱条件下,在同一块薄层板上点样、展开、检视,前者应显示清晰的斑点。

比移值(Rf)

系指从基线至展开斑点中的距离与从基线至展开剂前沿的距离的比值。鉴别时,可用供试品溶液主斑点与对照品溶液主斑点的比移值进行比较,或用比移值来说明主斑点或杂质斑点的位置

捕获.JPG

除另有规定外,比移值(Rf)应在0.2~0.8之间。

分离效能

鉴别时,在对照品与结构相似药物的对照品制成混合对照溶液的色谱图中,应显示两个清晰分离的斑点。杂质检查的方法选择时,可将杂质对照品用供试品自身稀释对照溶液溶解制成混合对照溶液,也可将杂质对照品用待测组分的对照品溶液溶解制成混合对照溶液,还可采用供试品以适当的降解方法获得的溶液,上述溶液点样展开后的色谱图中,应显示两个清晰分离的斑点。

测定法

鉴别

薄层色谱法用于鉴别时,可采用与同浓度的对照品溶液,在同一块薄层板上点样、展开与检视,供试品溶液所显主斑点的颜色(或荧光)与位置(Rf)应与对照品溶液的主斑点一致,而且主斑点的大小与颜色的深浅也应大致相同。或采用供试品溶液与对照品溶液等体积混合,应显示单一、紧密的斑点;或选用与供试品化学结构相似的药物对照品与供试品溶液的主斑点比较,两者Rf应不同,或将上述两种溶液等体积混合,应显示两个清晰分离的斑点。

杂质检查

薄层色谱法用于杂质检查时,可采用杂质对照品法、供试品溶液的自身稀释对照法,或两法并用。供试品溶液除主斑点外的其他斑点应与相应的杂质对照品溶液或系列浓度杂质对照品溶液的相应主斑点比较,或与供试品溶液的自身稀释对照溶液或系列浓度自身稀释对照溶液的相应主斑点比较,不得更深。

通常应规定杂质的斑点数和单一杂质量,当采用系列自身稀释对照溶液时,也可规定估计的杂质总量

薄层扫描法

系指用一定波长的光照射在薄层板上,对薄层色谱有吸收紫外光或可见光的斑点,或激发后能发射出荧光的斑点进行扫描,将扫描得到的图谱及积分数据用于药品的鉴别,杂质检查或含量测定。

除另有规定外,薄层扫描方法可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明,结合具体情况,选择反射方式,采用吸收法,或荧光法,用双波长或单波长扫描。测定方法有内标法及外标法,由于影响薄层扫描结果的因素很多,故薄层扫描定量测定应在保证供试品斑点的量在校正曲线的线性范围内的情况下,与对照品同板点样,展开,扫描,测量和计算。

用外标法测定时,若对照品各数据点在校正曲线上呈一通过原点的直线时,可用一点法校正,如不通过原点通常宜采用二点法校正,必要时用多点法校正。含量测定时,供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上,供试品点样不得少于4个,对照品每一浓度不得少于2个,薄层扫描定量用的对照品纯度应符合含量测定用对照品的要求。

参考资料

  1. [1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版:二部[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

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, 在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,与对照药材色谱相应的位置上,分别显相同颜色的斑点,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照无干扰。见图1。 2.2 知母的薄层鉴别 取本品20ml,用水饱和的正

薄层色谱分析步骤及注意事项

4步操作。 ⑴制板 在一平面支持物(通常为玻璃)上,均匀地涂制硅胶、化铝或其他吸附剂薄层、样品的分离、检测就在此薄层色谱板上进行。 一般选用适当规格的表面光滑平整的玻璃板。常用的薄层板规格有:10cm×20cm、5cm×20

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