高效液相色谱法

高效液相色谱法的定义高效液相色谱法是指具有高分离效能的柱液相色谱法[1]。高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱,对供试品进行分离测定的色谱方法[2]。注入的供试品,由流动相带入柱内,各组分在柱内被分离,并依次进入检测器,由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱法所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。色谱柱反相色谱系统使用非极性填充剂,常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶,以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用,辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等)也有使用。正相色谱系统使用极性填充...

高效液相色谱法

高效液相色谱法的定义

高效液相色谱法是指具有高分离效能的柱液相色谱法[1]

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱,对供试品进行分离测定的色谱方法[2]。注入的供试品,由流动相带入柱内,各组分在柱内被分离,并依次进入检测器,由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

对仪器的一般要求和色谱条件

高效液相色谱法所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。

色谱柱

反相色谱系统使用非极性填充剂,常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶,以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用,辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶(如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等)也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂,常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂;分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂;对映异构体的分离通常使用手性填充剂。填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充,直接影响供试品的保留行为和分离效果。分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在15nm(1nm=10A)以下的填料,分析分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。除另有规定外,普通分析柱的填充剂粒径一般在3~10μm之间,粒径更小(约2μm)的填充剂常用于填装微径柱(内径约2mm)。

使用微径柱时,输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配;如有必要,色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时,应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。

以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃,为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度,但不宜超过60℃。

流动相的pH值应控制在2~8之间。当pH值大于8时,可使载体硅胶溶解;当pH值小于2时,与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时,应选用耐碱的填充剂,如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机一无机杂化填充剂或非硅胶基键合填充剂等;当需使用pH值小于2的流动相时,应选用耐酸的填充剂,如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂、有机-无机杂化填充剂等。

检测

最常用的检测器为紫外检测器,包括二极管阵列检测器,其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器,其响应值不仅与供试品溶液的浓度有关,还与化合物的结构有关;蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器,对所有的化合物均有响应;蒸发光散射检测器对结构类似的化合物,其响应值几乎仅与供试品的质量有关;二极管阵列检测器可以同时记录供试品的吸收光谱,故可用于供试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查

紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与供试品溶液的浓度在一定范围内呈线性关系,但蒸发光散射检测器的响应值与供试品溶液的浓度通常呈指数关系,故进行计算时,一般需经对数转换。

不同的检测器,对流动相的要求不同。如采用紫外检测器,所用流动相应符合紫外-可见分光光度法(2010年版药典二部附录ⅣA)项下对溶剂的要求;采用低波长检测时,还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长,并选用色谱级有机溶剂。蒸发散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发性盐组分的流动相。

流动相

反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统(采用紫外末端波长检测时,首选乙腈-水系统),如经试用不适合时,再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液的流动相,必须使用时,应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态,故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统,流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%,否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化,造成色谱系统不稳定。

各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外,其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等,均可适当改变,以适应供试品并达到系统适用性试验的要求。其中,调整流动相组分比例时,以组分比例较低者(小于或等于50%)相对于自身的改变量不超过±30%且相对于总量的改变量不超过±10%为限,如30%相对改变量的数值超过总量的10%时,则改变量以总量的±10%为限。

对于必须使用特定牌号的填充剂方能满足分离要求的品种,可在该品种项下注明。

系统适用性试验

高效液相色谱法的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个参数。其中,分离度和重复性尤为重要。[2]

按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验,即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验,必要时,可对色谱系统进行适当调整,以符合要求。

色谱柱的理论板数(n)

用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同,采用理论板数作为衡量柱效能的指标时,应指明测定物质,一般为待测组分或内标物质的理论板数

在规定的色谱条件下,注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液,记录色谱图,量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR(以分钟或长度计,下同,但应取相同单位)和峰宽(W)或半高峰宽(Wh/2),按n=16(tR/W)2或n=5.54(tR/Wh/22计算色谱柱的理论板数。

分离度(R)

用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度,是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度,也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分(内标物质或其他难分离物质)的分离度,或将供试品或对照品用适当的方法降解,通过测定待测组分与某一降解产物的分离度,对色谱系统进行评价与控制。

无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外,待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。分离度的计算公式为:

分离度的计算公式

式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间;tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间;W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽(如图)。

捕获.JPG

当对测定结果有异议时,色谱柱的理论板数(n)和分离度(R)均以峰宽(W)的计算结果为准。

重复性

用于评价连续进样中,色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时,通常取各品种项下的对照品溶液,连续进样5次,除另有规定外,其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%;采用内标法时,通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液,加入规定量的内标溶液,配成3种不同浓度的溶液,分别至少进样2次,计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%。

拖尾因子(T

用于评价色谱峰的对称性。为保证分离效果和测量精度,应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为:

拖尾因子计算公式

式中W0.05h为5%峰高处的峰宽;

d1为峰顶点至峰前沿之间的距离(如图)。

捕获.JPG

除另有规定外,峰高法定量时T应在0.95~1.05之间。峰面积法测定时,若拖尾严重,将影响峰面积的准确测量。必要时,应在各品种项下对拖尾因子作出规定。

测定法

内标法

按各品种项下的规定,精密称(量)取对照品和内标物质,分别配成溶液,精密量取各适量,混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器,记录色谱图测量对照品和内标物质的峰面积或峰高,按下式计算校正因子

捕获.JPG

式中AS为内标物质的峰面积或峰高;

AR为对照品的峰面积或峰高;

cS为内标物质的浓度

cR为对照品的浓度

再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液,注入仪器,记录色谱图测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高,按下式计算含量:

捕获.JPG

式中AX为供试品的峰面积或峰高;

cX为供试品的浓度

A'X为内标物质的峰面积或峰高;

c'S为内标物质的浓度

f为校正因子

采用内标法,可避免因样品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。

外标法

按各品种项下的规定,精密称(量)取对照品和供试品,配制成溶液,分别精密取一定量,注入仪器,记录色谱图,测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积(或峰高),按下式计算含量:

捕获.JPG

式中各符号意义同上。

由于微量注射器不易精确控制进样量,当采用外标法测定供试品中成分或杂质含量时,以定量环或自动进样器进样为好。

加校正因子的主成分自身对照法

测定杂质含量时,可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时,按各品种项下的规定,精密称(量)取杂质对照品和待测成分对照品各适量,配制测定杂质校正因子的溶液,进样,记录色谱图,按上述(1)法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下,用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计算的杂质,通常以主成分为参照,采用相对保留时间定位,其数值一并载入各品种项下。

测定杂质含量时,按各品种项下规定的杂质限度,将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液,进样,调节检测灵敏度(以噪声水平可接受为限)或进样量(以柱子不过载为限),使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量程的10%~25%或其峰面积能准确积分[通常含量低于0.5%的杂质,峰面积的相对标准偏差(RSD)应小于10%;含量在0.5%~2%的杂质,峰面积的RSD应小于5%;含量大于2%的杂质,峰面积的RSD应小于2%]。然后,取供试品溶液和对照品溶液适量,分别进样,供试品溶液的记录时间,除另有规定外,应为主成分色谱峰保留时间的2倍,测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积,分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较,依法计算各杂质含量。

不加校正因子的主成分自身对照法

测定杂质含量时,若没有杂质对照品,也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述(3)法配制对照溶液并调节检测灵敏度后,取供试品溶液和对照溶液适量,分别进样,前者的记录时间,除另有规定外,应为主成分色谱峰保留时间的2倍,测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较,计算杂质含量。

若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离,则按规定先记录供试品溶液的色谱图Ⅰ,再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。色谱图Ⅰ上杂质峰的总面积(包括溶剂峰),减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积,即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。

面积归一化法

按各品种项下的规定,配制供试品溶液,取一定量注入仪器,记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积,计算各峰面积占总峰面积的百分率

用于杂质检查时,由于峰面积归一化法测定误差大,因此,通常只用于粗略考查供试品中的杂质含量。除另有规定外,一般不宜用于微量杂质的检查

参考资料

  1. [1] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.WS/T 455—2014 卫生监测与评价名词术语[Z].2014-11-15.
  2. [2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版:二部[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

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-3A液相色谱仪,SPD-1型紫外检测器,C-R1A型色谱数据处理机;美国Rheodyne 7725型液相色谱进样器。 色谱柱:μBondapak C18柱(250 mm×4.6 mm,10 μm);流动相:甲醇-水(70∶30);流速

反相高效液相色谱法测定猪血浆中异丙酚浓度

度采用的方法有气相色谱、液相色谱、气-质联用等方法。国内以液相色谱法较为普遍,但因实验条件不同.测定方法也各不相同.本实验建立了适合我院实验条件的测定猪血浆中异丙酚浓度的反相高效液相色谱方法。此法操作简单,灵敏度高.可适用于大动物实验的血

反相高效液相色谱法测定咪唑斯汀片含量

见有以高效液相色谱(HPLC)法测定该药含量的报道,故笔者根据国外有关文献报道,建立了其片剂的含量测定方法。l 仪器与试药1.1 仪器LC900高效液相色谱系统,包括PU一980型智能泵UV-975型紫外检测器、7725手动进样阈(日本J

高效液相色谱法测定洋蓟叶中洋蓟素含量

相高效液相色谱方法。 1 仪器与试剂 日本岛津SPD-10AT高效液相色谱仪: SPD-10Avp检测器;SIL-10AP自动进样器;超纯水器(arium 611UF,Sartorius);超声波清洗器(AS3120A,天津瑞森特);

高效液相色谱法测定鸡蛋中胆固醇研究

01,11(3):378. 4 黄岛平,陈建红.HPLC紫外检测器测定出口月饼中的胆固醇.光谱实验室,2001,18(4):499-501. 5 张蓉真,李珑.测定鸡蛋固醇高效液相色谱新方法.色谱,1998,16(2):91-94. 6

高效液相色谱法测定盐酸苯环壬酯片的含量

5型高效液相色谱仪;683紫外检测器;655—60微处理机;日本岛津UV—160A紫外分光光度计;盐酸苯环壬酯对照品(纯度为99.6%)及片剂(本所研制);苯基环戊基羟基乙酸(以下简称分解酸)、N-甲基-3-氮杂双环(3, 3, 1)壬-

高效液相色谱法测定奈韦拉平的血药浓度

奈韦拉平的平均血药浓度时间曲线 3讨论 测定人血浆中奈韦拉平浓度的方法有高效液相色谱法[3-4]和离子对色谱法[5]. 我们采用高效液相色谱法,血浆内源性杂质不干扰药物的测定. 采用磷酸盐缓冲溶液,调节pH=5,以获得较好的分

高效液相色谱法测定猪血清中的依维菌素

定可用紫外分光光度法和高效液相色谱法。血清样品基体复杂,干扰成分多,其测定相对困难,国外已有荧光衍生-HPLC法的报道,该法灵敏度高,但衍生化步骤繁琐,分析成本较高。本研究利用0.05%偏磷酸-甲醇(7:3,V/V)沉淀血清蛋白、乙酸乙酯

高效液相色谱法测定大鼠海马胆固醇

0只. 乙腈、异丙醇、无水乙醇等都为色谱纯试剂,标准胆固醇(HPLC级)为美国Sigma公司产品. VARIAN Prostar 210高效液相色谱仪 (美国VARIAN公司生产),配置Prostar 210高压泵、VARIAN Pros

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高效液相色谱法的定义高效液相色谱法是指具有高分离效能的柱液相色谱法[1]。高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵...

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